新芝生物组织研磨仪助力“非洲猪瘟”样品处理

问题一、什么是非洲猪瘟？

　　非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染家猪和各种野猪(不传染人)引起一种急性、出血性、烈性传染病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，且只能依靠实验室监测确诊。

　　2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情。

问题二、目前在中国的传染范围？

　　自8月初我国首次发现非洲猪瘟以来，截至11月22日，全国有20个省份47个市(区、盟)发生73起家猪疫情、1起野猪疫情，累计扑杀生猪60万头。全国非洲猪瘟疫情呈现多点散发状态，但在各地动物疾控部门的积极行动下，疫情开始趋于平稳，总体防控有效。

问题三、非洲猪瘟检测的样品处理方法介绍

一、非洲猪瘟样品处理

1. 目的

　　规范ASFV样品和实验材料的处理程序，保证ASFV相关实验的顺序开展和实验室的生物安全。

2. 适用范围

　　适用于疑似ASFV临床样品的实验前的处理

3. 程序

3.1实验材料

　　ASF的易感动物，主要为家猪、野猪和蜱，通常采集的样品为家猪、野猪的血液样品、组织样品以及蜱三类。田间采集的样品通常需要经过简单的预处理，才能进行后续的检测、诊断工作。

　　血清：用于病毒核酸检测、病毒抗原和抗体检测。将采好的猪血的注射器或采血管在室温下倾斜静止2~4h(防止暴晒)，或置于37℃温箱内1h，待大部分血清析出后，取出血清，必要时经离心分离血清。(最低建议量5ml)。

　　抗凝全血：用于病毒核酸检测和病毒抗原检测。

　　采血前，在真空采血管或注射器内按比例加入抗凝剂。采集血液，轻轻上下颠倒，使血液与抗凝剂充分混匀，防止血液凝固的同时避免溶血。也可以将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡脱落纤维蛋白。必要时，可加入双抗以抑制血源性或采血过程中可能出现的细菌污染。

　　当血样用于病毒核酸检测时，一般不用肝素而选用EDTA作为抗凝剂。(最低建议量1mL)。

　　组织样本：活体采集，采用扁桃体，用于临床健康动物ASF监测。

　　尸体剖检ASF发病动物或死亡动物经解剖取材，包括：ASFV靶器官的采集：脾脏、淋巴结、肾脏、扁桃体。

　　其他病变组织脏器的采集：采集具有明显病变的肝脏、肺脏、心脏等组织器官，选取部位在病变和健康组织交界处。

　　腐败动物尸体的样品采集：剖检取股骨，将附着的肌肉和韧带等全部剔除，采集骨髓。最低建议量5克。

　　蜱的采集：蜱可进行核酸检测、抗原检测和蜱的形态学鉴定，查找猪圈的墙边、墙缝、木质或瓦质的屋顶，或挖掘猪圈地面均可能找到蜱，也可查看猪表皮，采集蜱。

1-1样品保存条件

注：用于病毒分离和病理学检测的样品禁止-20℃保存。

3.2实验器材和试剂

　　台式高速冷冻离心机、组织研磨仪、水浴锅、计时器、冰箱和移液器等。

　　无菌的剪子、镊子、钢珠、2mLEP管、移液器吸头(10μL,200μL、1000μL)等。

　　其他试剂和耗材主要包括：0.01mol/L PBS(PH7.2)、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。

3.3样品处理程序

3.3.1血清及全血样品处理

　　取血清或全血样品1mL于灭菌EP管里，保存备用

3.3.2组织样品处理

　　适用于脾脏等组织样品和蜱的处理。尽可能减少污染，每取一个组织块或蜱，用火焰消毒剪镊等取样器械，组织块应分别放入灭菌容器内并立即密封，做好标记，注意防止组织间相互污染。

    3.3.2.1组织样品的处理应在二级生物安全柜中进行，勿使液体溅到生物安全柜中

　　3.3.2.2将0.1-0.2g组织块放入2mLEP管中，用剪刀剪成碎块，加1-2mL0.01mol/L PBS(PH7.2),再加入1-2粒灭菌钢珠，密封后，表面消毒备用。剩余样品放回容器内，重新密封，表面消毒后保存-70℃冰箱。

　　3.3.2.3组织样品的破碎可以利用组织研磨仪在生物安全柜外操作，将样品制成组织悬液。

　　重磅推荐使用Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器!

3.4病毒灭活

　　病毒的灭活处理应在二级生物安全柜中进行，将处理好的血清、全血或者研磨破碎后的组织样品连同EP管放入60℃水浴中，放置30min灭活。

3.5使用后仪器处理

　　剪刀、镊子等均应放入消毒缸进行消毒，放入铁饭盒内，并装入密封袋内进行高压灭菌处理。装有组织样品保存液的容器和盛有组织块的离心管应密封管口，表面消毒后放入密封袋中高压灭菌。钢珠、吸头等废弃物应用0.8%NaOH浸泡30分钟消毒后，置密封袋内高压灭菌。消毒残液应装入密封容器内高压灭菌处理。

3.6注意事项

　　操作之前要确认生物安全柜和实验室已进行了彻底的卫生消毒处理，防止样品间交叉感染。