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RT-PCR虚拟实验-2

【总RNA提取】
  【出现工作台界面】
  【左侧】:电动匀浆机*、台式离心机、盛有冰的容器(不带盖)、玻璃平皿**、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管、1ml匀浆瓶、无菌手术刀*、无菌手术镊*、计时器
           *鼠标箭头放上:说明框显示:“DEPC水处理过”,3秒钟后消失;
**鼠标箭头放上:说明框显示:“所有玻璃器皿先用酸处理,冲洗干净,高压消毒”,3秒钟后消失)
   【右侧】:待提取组织(肝脏)、DEPC水*、异丙醇、氯仿、75%冰乙醇
            (*鼠标箭头放上:一秒钟后“实验注意”显示:1%焦碳酸二乙酯:去除外源性RNA酶)
   【画面中央】:工作台:一块象征性的平台,有“工作台”字样
            (鼠标箭头放上:一秒钟后“实验注意”显示:DEPC水处理过)
   【画面右下角】:垃圾桶(有骷髅头图形标记)
   【界面按钮设计】:实验注意:有内容时自动显示
                    实验提示:步箭头放上自动显示,以后每一步均自动显示
                     重新操作:返回到上一步结束
退出实验:回到本步骤界面
退出运行:回到首页
关闭音乐:实验开始,背景音乐自动响起。按此键,即关闭音乐
【操作开始】
1、工作台中央的盛冰的容器---容器中放有和容器口齐平的碎冰。
   实验提示:按顺序选择玻璃平皿、肝脏组织、手术刀,切碎标本。
 
2、切碎标本 ------ 选择玻璃平皿放置于盛冰容器中央,拖动肝脏组织放置于玻璃平皿中(鼠标箭头放置于肝脏上时,说明框显示:0.1g小鼠肝脏,3秒钟后隐去)。点击无菌手术刀,拖动手术刀至肝脏组织上(该动作完成后,自动出现说明框:切碎肝脏组织,同时手术刀上下做切碎动作,三秒钟后动作停止,手术刀回到原位)。
   实验提示:使用无菌镊子,将肝脏组织放入1ml匀浆瓶内。
 
3、移动1ml 匀浆瓶----点击匀浆瓶,并拖动至工作台中央的冰盒内;点击无菌镊子,鼠标变为镊子形状,将玻璃平皿上的切碎组织夹入匀浆瓶内(该动作完成后,玻璃平皿及无菌镊子回到工作台界面原位)
     实验提示:点击微量吸液器,点击装有枪头的塑料盒,盒打开。微量吸液器装上枪头,拖动微量吸液器至Trizol处,吸取Trizol,加入EP管。
 
4、加入Trizol---- 1 点击微量吸液器(说明框显示“吸取1ml液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“1ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上(枪头为蓝色);3点击微量吸液器,拖动至Trizol处,点击Trizol(枪头内显示吸取1ml红色液体);4拖动微量吸液器至匀浆瓶处,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,微量吸液器回到吸液架上。
    实验提示:选择匀浆机;拖动匀浆瓶至匀浆机;点击匀浆机,匀浆两次,至匀浆瓶内液体变为均一液体。
 
    5、匀浆----
①    动画显示逆时针拧松电机套下端连接螺纹(不用全部拧下),插入1ml匀浆杵子后顺时针拧紧(如插入较紧时可边插边用手往上拧)。文本框显示“拧松电机套下端连接螺纹(不用全部拧下),插入1ml匀浆杵子后拧紧(如插入较紧时可边插边用手往上拧)”
②    将1ml匀浆瓶夹在试管夹上,对好中心,握住手柄上下试动,至完全对直,再把瓶子夹紧(动画显示红色手柄下拉,匀浆杵子伸入匀浆瓶内,瓶子夹紧后自动恢复)
③    点击冰盒,拖动到匀浆瓶底部,打开冰盒盖,使匀浆瓶底部接触冰。(文本框显示“加冰浴防止温度升高使组织失活”) 冰盒 开盖后里面的冰
④    打开电源开关,把调速调至最小,右手把握控制手柄,
运动杵子至瓶口配合处,调节调速旋扭至所要的速度。即开始匀浆,控制手柄向下运动至瓶底部(不能太用力),再往上运动至与瓶配合处,往复运动至成红色均一液体。
       ⑤ 匀浆机回到原位置,匀浆瓶仍位于冰盒中,将匀浆瓶内液体倒入1.5ml离心管内,离心管置于冰盒内,匀浆瓶自动消失。
 
文本框显示:
“实验注意:1、电动玻璃匀浆机严禁在匀浆杵子未放入匀浆器内时悬转,及无放入组织、液体等空瓶研磨。
2、      如使用中由于负载过大(往往运动过快)发生卡住时,手柄应速向上运动但匀浆杵子不脱离液面。
3、      匀浆要彻底,如一次匀浆不彻底,需再进行一次”
 
          实验提示:点击EP管,拖出冰盒,点击计时器,室温下静置5分钟。
实验提示:静置使细胞充分裂解,核蛋白中核酸与蛋白解离。
 
     6、静置---- 1点击EP管,拖动EP管至冰盒外,冰盒回到原位;2点击计时器,拖动计时器至操作台中央;3再次点击计时器,开始计时(音乐出现倒计时声音,说明框显示“室温静置5分钟”,持续时间3秒钟后隐去),说明框隐去后倒计时声音停止,计时器退回原位置,冰盒移动至操作台中央,EP管自动至冰盒内。
        实验提示: 点击微量吸液器,加入枪头,吸取0.2ml氯仿。
 
 7、加入氯仿----点击微量吸液器(说明框显示“吸取0.2ml液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“0.2ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动至氯仿处,点击氯仿(枪头内显示吸取0.2ml液体;实验注意:必需按总体积的1/5加入);4拖动微量吸液器至EP管处,EP管盖子打开,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到吸液架上。
         实验注意:氯仿的作用:1、促进有机相和水相的分离;2、去除上清中痕量的酚。
实验提示:剧烈振荡
 
8、振荡---- 1点击EP管(说明框内显示:剧烈震荡15s。EP管上下颠倒混匀振荡,3秒钟后停止,重新位于冰盒内)
     实验提示:静置10分钟
 
      9、静置---- 1点击计时器,拖动计时器至操作台中央;3再次点击计时器,开始计时(音乐出现倒计时声音,说明框显示“静置10分钟”,持续时间5秒钟后隐去),说明框隐去后倒计时声音停止,计时器退回原位置。
      实验提示:点击离心机,配平,开始离心
 
 10、离心---- 1点击离心机,拖动离心机至操作台中央,离心机盖子自动打开,其内可见已放置一配平管(说明框显示“配平管”,持续3秒钟后隐去);2拖动EP管至配平管对面(其余孔不能放进,放置正确后,离心机盖子自动关闭);3提示框出现:“选择温度______℃”,“选择转速­­______g”,“选择时间______min”,实验提示分别显示“4℃、12000g、15min”,若提示框内填写正确,提示框自动消失;若任何一项填写错误,提示框持续存在;4点击离心机,开始离心,画面停顿5秒钟后,离心机盖子自动打开(说明框显示“离心结束”),EP管自动出现在操作台中央(EP管内液体分为3层:上层无色透明液体,约0.5ml,鼠标置于该液体层,说明框内显示:“水相”,约3秒钟后说明框隐去;中间白色不透明液体,约0.1ml,鼠标置于该液体层,说明框内显示:“蛋白变性层”,约3秒钟后说明框隐去;下层为红色不透明液体,约0.6ml,鼠标置于该液体层,说明框内显示:“有机相”,约3秒钟后说明框隐去;),离心机盖子盖上,回到原位。
    实验提示:选择新的EP管,点击微量吸液器,装好枪头,转移水相液体至新的EP管内。
 
11、转移---- 1点击操作台左侧另外一只新EP管,并拖动至操作台中央,EP管盖子自动打开;2点击微量吸液器(说明框显示“吸取水相液体”,3秒钟后隐去);3点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“0.5ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;拖动微量吸液器至原EP管旁,原EP管盖子自动打开;4微量吸液器伸入原EP管水相液体底层(实验注意提示:“不要碰到蛋白变性层”,),点击微量吸液器吸取0.5ml液体,拖动微量吸液器至新EP管内,再次点击微量吸液器,枪头内液体注入新EP管内;5重复步骤4。6原EP管盖子自动盖上,自动转移至垃圾桶内;微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到原位置;新EP管位于操作台中央。
     实验提示:用微量吸液器加入等体积异丙醇。
 
12、加入异丙醇-----1点击微量吸液器(说明框显示“吸取0.5ml液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“0.5ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动至异丙醇处,点击异丙醇(枪头内显示吸取0.5ml无色透明液体;实验注意:加入等体积异丙醇);4拖动微量吸液器至EP管处,EP管盖子打开,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到原位置。
        实验注意:异丙醇的作用:沉淀RNA
实验提示:温和颠倒混匀
 
13、混匀---- 1点击EP管(说明框内显示:温和颠倒混匀。3秒钟后停止)
     实验提示:室温静置10分钟
 
14、静置---- 1点击计时器,拖动计时器至操作台中央;3再次点击计时器,开始计时(音乐出现倒计时声音,说明框显示“室温静置10分钟”,持续时间5秒钟后隐去),说明框隐去后倒计时声音停止,计时器退回原位置, EP管位于操作台中央。
    实验提示:离心10分钟
 
15、离心---- 1点击离心机,拖动离心机至操作台中央,离心机盖子自动打开,其内可见已放置一配平管(说明框显示“配平管”,持续3秒钟后隐去);2拖动EP管至配平管对面(其余孔不能放进,放置正确后,离心机盖子自动关闭);3提示框出现:“选择温度______℃”,“选择转速­­______g”,“选择时间______min”,实验提示分别显示“4℃、12000g、10min”,若提示框内填写正确,提示框自动消失;若任何一项填写错误,提示框持续存在;4点击离心机,开始离心,画面停顿3秒钟后,离心机盖子自动打开(说明框显示“离心结束”),EP管自动出现在操作台中央(EP管内液体为无色透明液体,EP管底部可见一小块白色固体物质),离心机盖子盖上,回到原位。
     实验提示:弃去上清
 
16、弃上清----- 1 点击EP管,EP管盖子打开,同时鼠标变为戴一次性手套的手的形状;2手抓住EP管,EP管自动缓慢倾斜,将其内液体倒入垃圾桶内(音乐出现倒水的声音,过程持续3秒钟);3EP管复位,内无液体,底部仍可见白色固体物质,EP管盖子保持打开。
     实验提示:加入1ml冰乙醇
 
17、加入冰乙醇 ---- 1点击微量吸液器(说明框显示“吸取1ml液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“1ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动至冰乙醇处,点击异丙醇(枪头内显示吸取1ml无色透明液体;说明框显示:乙醇已预冷);4拖动微量吸液器至EP管处,EP管盖子打开,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到吸液器架上。
       实验注意:冰乙醇的作用:脱水、除盐。
       实验提示:离心
 
18、离心---- 1点击离心机,拖动离心机至操作台中央,离心机盖子自动打开,其内可见已放置一配平管(说明框显示“配平管”,持续3秒钟后隐去);2拖动EP管至配平管对面(其余孔不能放进,放置正确后,离心机盖子自动关闭);3提示框出现:“选择温度______℃”,“选择转速­­______g”,“选择时间______min”,实验提示分别显示“4℃、7500g、5min”,若提示框内填写正确,提示框自动消失;若任何一项填写错误,提示框持续存在;4点击离心机,开始离心,画面停顿3秒钟后,离心机盖子自动打开(说明框显示“离心结束”),EP管自动出现在操作台中央(EP管内液体为无色透明液体,EP管底部可见一小块白色固体物质),离心机盖子盖上,回到原位。
        实验提示:弃上清
 
19、弃上清--- 同步骤16
        实验提示:空气干燥5-10分钟
 
20、空气干燥---- 1 画面停顿5s钟,说明框显示“空气干燥10min”。
       实验注意:空气干燥的作用,使乙醇挥发。
       实验提示:加入DEPC水,溶解。
 
21、加入DEPC水---- 1点击微量吸液器(说明框显示“吸取50ul液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“0.1ml枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动至DEPC水处,点击(枪头内显示吸取无色透明液体;说明框显示:1%DEPC水);4拖动微量吸液器至EP管处,EP管盖子打开,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,EP管底部白色物质逐渐消失,变为无色透明液体;微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到原位置。
       实验注意:怎么还不溶?55-60℃水浴可助溶,但时间需控制在10分钟以内。
            实验注意:提取的总RNA置于4℃或冰浴中,立即用于下游实验,或立即置于-80℃冰箱保存。但无论采用何种方法提取和保存的RNA,都往往会被很快降解,因而建议避免提取RNA后保存。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
【对提取的总RNA进行分析】
【出现工作台界面】
【左侧】:电泳槽、电泳仪、紫外灯、电子天平(内有称量纸一张)、微波炉、小药勺、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、置冰盒中EP管(2只,其中一只内含有少量无色透明液体,鼠标箭头放上,说明框显示:“已提取的总RNA”)、塑料薄膜、三角烧瓶、50ml量筒
   【右侧】:琼脂糖(白色粉末)、加样缓冲液(蓝色)、溴乙锭*(桔红色)
            实验注意:溴乙锭【Ethidium Bromide,EB】:是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。EB是强的变性剂,具有致癌性,操作时必须戴手套!!! 由于EP具有毒性,实验结束后,应对含有EB的溶液进行净化处理!!!!!你知道什么叫净化处理吗
   【画面中央】:工作台:一块象征性的平台,有“工作台”字样
   【画面右下角】:垃圾桶(有骷髅头图形标记)
   【界面按钮设计】:实验注意:有内容时自动显示
                    实验提示:步箭头放上自动显示,以后每一步均自动显示
                    重新操作:返回到上一步结束
退出实验:回到本步骤界面
退出运行:回到首页
关闭音乐:实验开始,背景音乐自动响起。按此键,即关闭音乐
【操作开始】
      实验提示:点击电子天平,点击药勺,称取琼脂糖0.25g。
1、   称取琼脂糖 ----- 1点击电子天平,拖动至操作台中央,电子天平拉门自动打开,可见托盘上已有滤纸一张;2点击药勺,并拖动至琼脂糖处;3点击药勺(动画演示药勺挖取琼脂糖若干),并拖动至电子天平内(动画演示药勺倾斜,琼脂糖落入天平内称量纸上),药勺回原位,电子天平门关上,说明框显示:“0.3g琼脂糖”,3秒钟后滤纸连同琼脂糖自动位于操作台桌面上,电子天平回到原位。
           实验提示:点击量筒,量取1×TAE电泳缓冲液25ml。
 
2、   量取电泳缓冲液----- 1点击量筒,拖动至操作台中央;2点击装有电泳缓冲液的试剂瓶,试剂瓶盖子自动打开,鼠标变为手的形状,移动“手”,抓住试剂瓶,将其内的液体倾倒入量筒内(音乐出现倒水的声音,说明框显示“量取25ml液体”,3秒钟后试剂瓶回到原位,盖子盖上,量筒内显示25ml液体,鼠标变为正常形状)。
           实验提示:点击三角烧瓶,将琼脂糖及量好的电泳缓冲液倒入烧瓶内,并使用微量吸液器,加入1.25ulEB(溴乙锭),于微波炉内加热,溶解琼脂糖。
 
3、   溶解琼脂糖----- 1点击三角烧瓶,并拖动至操作台中央;2点击放有琼脂糖的滤纸,鼠标变为手的形状,抓住琼脂糖滤纸,将琼脂糖倒入三角烧瓶内;3“手”抓住量筒,将量筒内液体倒入三角烧瓶(音乐出现倒水的声音),3秒钟后液体倒完,鼠标变回原来的形状,量筒回到原位置,滤纸回到垃圾桶内;4点击微波炉,并拖动至桌面中央,微波炉盖子打开; 5点击三角烧瓶,鼠标变为手的模样,抓住三角烧瓶,移动至微波炉内,三角烧瓶口自动出现一盖子,微波炉盖子关闭; 6点击微波炉,说明框显示“溶解琼脂糖”,琼脂糖颗粒逐渐溶解,变为无色透明液体,持续约30秒钟,微波炉盖子打开。实验注意:小心!不要使琼脂糖满溢至烧瓶外! 7点击微波炉内的三角烧瓶,鼠标变为一只白色工作手套状,自动拿起三角烧瓶,放置于操作台桌面上,画面停顿3秒钟(说明框显示:冷却至大约60℃,不要冷却时间过长,避免琼脂糖凝固);8点击微量吸液器,并拖动至操作台中央,点击微量吸液器枪头,枪头装至微量吸液器上;拖动微量吸液器至溴已锭处,说明框显示“有毒,小心操作,并出现一骷髅头画面”,3秒钟后消失;9点击微量吸液器,动画显示淡红色液体吸入枪头的画面,说明框显示“吸取1.25ul溴已锭”,3秒钟后消失;10拖动微量移液器至三角烧瓶内,烧瓶盖子自动至垃圾桶,画面显示液体注入到瓶内的画面,枪头自动到垃圾桶,微量吸液器回到移液架。
        实验提示:将加样梳放置于胶板上,将溶解后的琼脂糖倒入胶板内,待琼脂糖凝胶凝固后拔出点样梳。
        实验注意:凝胶颗粒必须完全溶解【图示琼脂糖完全溶解和部分溶解对实验结果影响的图】
 
4、   浇板----- 1点击胶板,并拖动至操作台中央;2点击点样梳,点样梳自动架至胶板一端,说明框显示“齿梳的底部离胶板平面的距离为0.5-1mm”;3点击三角烧瓶,鼠标变为戴手套手的形状,抓住三角瓶,三角烧瓶缓慢倾倒,液体注入胶板内,胶板内液体逐渐增加(画面要有液体为稍粘稠的感觉),说明框内显示“注意避免气泡”,3秒钟后说明框隐去,液体倒完,鼠标变为原形状,三角烧瓶回到原位置;4胶板内的琼脂糖胶在室温逐渐凝固成半透明的乳白色的固体(约3秒钟),点击点样梳,点样梳回到原位,画面显示胶板内的琼脂糖为乳白色半透明的固体,一端可见点样孔。
            实验提示:点击并拖动电泳槽至操作台中央,将胶板小心放入电泳槽内。
 
5、   准备电泳槽 ----- 1点击电泳槽,并拖动电泳槽至操作台中央,其内可见无色透明液体(说明框显示:1*TAE电泳缓冲液);2 点击胶板,鼠标变为手的形状,把胶板将其放入电泳槽内(实验注意显示:点样孔一端置电泳槽的阴极)。   
实验提示:使用微量吸液器,吸取5ul总RNA,点于塑料薄膜上.
 
6、吸取样品 ---- 1点击含有RNA的EP管,并拖动至操作台中央,EP管盖子打开;2点击塑料薄膜,拖动至操作台中央;3点击微量吸液器(说明框显示“吸取5ul总RNA液体”,3秒钟后隐去);4点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“10ul枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;5拖动微量吸液器至EP管处,点击微量吸液器(出现EP管内含有总RNA的液体吸入枪头内的画面);6拖动微量吸液器至塑料薄膜处,点击微量吸液器,吸液器内液体滴入到塑料薄膜上(液体为一个小水滴状);7EP管盖子自动盖上,微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到移液架上。
实验提示:使用微量吸液器吸取6×上样缓冲液(Loading buffer)1ul,滴入塑料薄膜上的总RNA液滴中,反复吸取几次,混匀,避免气泡出。
 
7、吸取上样缓冲液---- 1点击微量吸液器(说明框显示“吸取1ul液体”,3秒钟后隐去);2点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“10ul枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3拖动微量吸液器至上样缓冲液处(蓝色),点击微量吸液器(出现EP管内液体吸入枪头内的画面);4拖动微量吸液器至塑料薄膜处,点击微量吸液器,吸液器内液体被打到塑料薄膜上的总RNA的液滴内(液体为一个小水滴状),反复吸取液体几次,混匀,液体变为均匀淡蓝色;5微量吸液器枪头自动至垃圾桶,微量吸液器回到原位置。
      实验提示:点击电泳槽,将塑料薄膜上的液体加入到电泳槽上的凹槽内。
 
8、上样 ---- 1点击电泳槽,并拖动至操作台中央(电泳槽内靠近阴极侧可见一排点样孔);2点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“10ul枪头”,3秒钟后隐去),枪头加入到微量吸液器上;3拖动微量吸液器至塑料薄膜处,点击塑料薄膜上的液体(出现塑料薄膜上液体吸入枪头的画面);4拖动微量吸液器至凝胶板上的点样孔处,点击微量吸液器(出现液体注入凝胶孔内的画面,液体为淡蓝色的液体)。
        实验提示:点击电泳仪,连接正负极,开始电泳。
 
9、电泳 ----- 1点击电泳仪,电泳仪移动至操作台中央;2点击电泳槽上的“阴极”显示扭,链接到电泳仪的“阴极”(出现黑色导线链接两端的画面),点击电泳槽“阳极”显示扭,链接到电泳仪的“阳极”(出现红色导线链接两端的画面);2持续点击电泳仪上“电压选择”按钮,电泳仪显示屏上电压从“50V”快速升高到“100v”;持续点击电泳仪上“时间选择”按钮,电泳仪显示屏上时间从“10min”快速升高到“30min”;点击电泳仪上“开始”按钮,说明框显示“开始电泳”,画面显示电泳仪阴极不断出现很多微小气泡,蓝色液体逐渐向阳极移动(画面持续5秒钟);3说明框显示“30分钟后”,蓝色液体移动至琼脂糖凝胶的中间。
        实验提示:点击紫外分析仪,观察结果。
 
10、观察结果---- 1点击紫外分析仪,紫外分析仪自动移动至操作台中央;2点击电泳槽,拖动琼脂糖凝胶至紫外分析仪中的平板上。电泳仪、电泳槽回到原位;3点击紫外分析仪,观察结果,画面显示“三条带”,说明框显示“28s ,18s,5sRNA”。
实验提示:准备分光光度计分析RNA纯度,点击EP管,稀释RNA。
 
    11、准备EP管----点击新的EP管,并拖动至工作台中央的冰盒内(EP管外显示刻度0.5ml,1.0ml,鼠标置于EP管上,说明框内显示“1.5mlEP管”,3秒钟后隐去)。
实验提示:加入DEPC水98ul
 
12、加入DEPC水98ul---- 1 点击微量吸液器(说明框显示“吸取98ul液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“100ul枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动DEPC水处,点击DEPC水(枪头内显示吸取98ul白色液体);4拖动微量吸液器至EP管处,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器回到原位置。
实验提示:加入RNA2ul
 
    13、加入RNA2ul ---- 1 点击微量吸液器(说明框显示“吸取2ul液体”,3秒钟后隐去);2 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“10ul枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;3点击微量吸液器,拖动RNA处,点击RNA水(枪头内显示吸取2ul白色液体);4拖动微量吸液器至EP管处,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器回到原位置。
 实验提示:将稀释的RNA加入比色皿中
 
     14、将稀释的RNA加入比色皿中----①点击比色皿,并拖动至工作台中央的冰盒内,② 点击微量吸液器(说明框显示“吸取100ul液体”,3秒钟后隐去);③ 点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“100ul枪头”,3秒钟后隐去),加入到微量吸液器上;④点击微量吸液器,拖动稀释的RNA处,点击稀释的RNA水处(枪头内显示吸取100ul白色液体);⑤拖动微量吸液器至EP管处,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器回到原位置。
实验提示:点击分光光度计,分析RNA纯度
 
15、点击分光光度计,分析RNA纯度----1点击分光光度计,拖动分光光度计自动移动至操作台中央,分光光度计盖子自动打开;2将比色皿加入分光度计内,分光光度计盖子自动合上;3点击“开始分析”,观察结果,画面显示A260/A280=2.0”。
 
实验注意:通过电泳的结果观察分析提取的总RNA有无降解:完整的RNA的电泳可明显观察到28s和18s两条带,并且28s大约是18s的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解。
RNA的纯度确定:A260/A280≈2.0,如果A260/A230<2,除盐不充分。
计算RNA的浓度:RNA原液的浓度=(A260-A230)*稀释倍数*40(ng/ul)
 
【逆转录】
  【出现工作台界面】
  【左侧】:PCR仪、盛有冰的容器(不带盖)、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管
   【右侧】:总RNA、MgCl2(25mM)(无色液体,水滴状表示)、Reverse transcription 10*Buffer(白色透明波浪状液体)、dNTP Mixture(10mM)(A、T、G、C)、RNase Inhibitor(白色球状液体)、Random 9 mers(单链RNA状)、Reverse Transcriptase(   状)、DEPC水(水滴状)
   【画面中央】:工作台:一块象征性的平台,有“工作台”字样
   【界面按钮设计】:实验注意:有内容时自动显示
                    实验提示:步箭头放上自动显示,以后每一步均自动显示
                    重新操作:返回到上一步结束
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【操作开始】
       实验提示:将2ul总RNA加入EP管,点击PCR仪,70℃孵育10分钟。
1、 孵育 ---- 1点击EP管, EP管盖子自动打开,EP管自动移动至桌面中央;2点击微量吸液器(说明框显示“吸取2ul液体”,3秒钟后隐去);3点击装有消毒枪头的塑料盒(说明框显示“10ul枪头”,3秒钟后隐去),枪头自动加入到微量吸液器上(枪头为黄色);4点击微量吸液器,拖动至总RNA处,点击总RNA(枪头内显示吸取2ul无色透明液体);5拖动微量吸液器至EP管处,点击微量吸液器(出现枪头内液体注入EP管内的画面),液体注入后,EP管盖子盖上,微量吸液器回到移液架上,枪头自动至垃圾桶内;6点击PCR仪,并拖动至操作台中央,PCR仪盖子自动打开;7拖动EP管放入PCR仪内,PCR仪盖子自动盖上(说明框显示:孵育:______℃,时间:­_______分钟;实验提示:孵育70℃,10分钟,若填错,实验不能继续);8说明框显示:“10分钟后”,3秒钟后隐去,PCR仪盖子自动打开,EP管位于桌面上的冰盒内,PCR仪盖子关上,PCR仪回到原位。
         实验注意:去除RNA二级结构。
      实验提示:将EP管立即拖动至盛有冰的容器内。
 
2、配制反应液----- 1点击MgCl2(25mM),说明框显示:加入______ul,实验提示:4ul,若填错,实验不能继续;填写正确后,MgCl2(25mM)自动加入EP管内,EP管内液面上升;2点击Reverse transcription 10*Buffer,说明框显示:加入______ul,实验提示:2ul,若填错,实验不能继续;填写正确后Reverse transcription 10*Buffer自动加入EP管内,EP管内液面上升;3同上依次加入dNTP Mixture(10mM) 2ul、RNase Inhibitor 0.5ul、Random 9 mers 1ul、Reverse Transcriptase 1ul、DEPC水 7.5ul;4加入完成后,EP管盖子自动盖上,自动混匀。
实验注意:以上液体加入不分先后顺序,均需使用微量吸液器。
       实验提示:点击PCR仪,进行cDNA反应。
 
3、逆转录----- 1点击PCR仪, PCR仪自动移动至操作台中央,盖子自动打开;2拖动EP管放入PCR仪内,PCR仪盖子自动盖上,冰盒回到原位(说明框显示:30℃,_______分钟;42℃,_______分钟;95℃,_______分钟;5℃,_______分钟。实验提示显示:10分钟,15分钟,5分钟,5分钟)。3填写完毕后,说明框提示:开始运行,5秒钟后隐去,PCR仪盖子打开,EP管位于操作台中央,PCR仪回到原位。
         实验提示:cDNA制备完成。
         各种温度设置的作用
 
 
 
 
 
 
 
 
【RT-PCR扩增hTNF-α基因】
  【出现工作台界面】
  【左侧】:PCR仪、振荡器、微量取液器、盛有消毒枪头的塑料盒、EP管
   【右侧】:cDNA模板(DNA双链结构样表示)、MgCl2(25mM) (无色液体,水滴状表示)、10*Buffer(白色透明波浪状液体)、dNTP Mixture(10mM)(AGTC)、Taq酶(   样,鼠标放上实验注意:-20℃保存,切勿反复冻融)、Forward引物(白色透明水滴状液体)、Reverse 引物(白色透明水滴状液体)、DEPC水(无色水滴状液体)
   【画面中央】:工作台:一块象征性的平台,有“工作台”字样
   【画面右下角】:垃圾桶(有骷髅头图形标记)
   【界面按钮设计】:实验注意:有内容时自动显示
                    实验提示:步箭头放上自动显示,以后每一步均自动显示
                    重新操作:返回到上一步结束
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