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RT-PCR虚拟实验-1

【标题页】 
              生物化学与分子生物学虚拟实验室
  点击按钮:基础知识(以下为一组):
1实验目的、2实验原理、3注意事项、4关键试剂与实验器材
虚拟实验(以下为一组):
1 总RNA提取、2 逆转录、3PCR反应
 
【实验目的】
 实验目的:熟悉RT-PCR的反应原理、掌握RT-PCR反应的操作步骤及RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法。
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【实验原理】
实验原理:
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction PCR)或称体外基因倍增,是一种体外扩增DNA片段的技术。PCR技术即在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合的酶促反应。其特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。
PCR技术一般需进行以下三个过程:
变性:加热模板DNA,使双链DNA分子解离成单链DNA。
退火:当温度下降时,引物DNA与所要扩增基因两侧的DNA配对形成局部杂交链。
延伸:在合适的温度,合适的缓冲液,Mg2+及4种dNTP存在条件下,DNA聚合酶引物3’-OH游离端,根据模板的碱基顺序合成新的互补链。
      上述三个过程即变性-退火-延伸为一个循环,如此重复进行,经30次左右的循环,模板DNA在数小时扩增倍数为(1+X)n。X为扩增效率,n为循环次数。
      逆转录PCR(RT-PCR)又称RNA-PCR,首先提取组织细胞总RNA,加入与mRNA3’端互补引物,在逆转录酶作用下合成cDNA,然后以cDNA为PCR模板,加入与cDNA互补的另一引物进行PCR扩增。RT-PCR可用于cDNA克隆,cDNA文库构建,基因表达研究等。
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【注意事项】
在所有的RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败 的主要原因是RNA酶的污染。
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【关键试剂与实验器材】
关键试剂:Trizol、氯仿、异丙醇、1%的DEPC水、逆转录试剂盒、PCR试剂盒
实验器材:电动匀浆器、振荡器、冷冻离心机、小型台式高速离心机、常规PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计等。                                   
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